基于其高靈敏度和便攜性,細(xì)胞傳感器已成為傳統(tǒng)毒物毒性評(píng)價(jià)的一種具有吸引力的評(píng)估手段。近年來,許多研究表明三維的細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境可以更好地模擬體內(nèi)微環(huán)境,從而更準(zhǔn)確地監(jiān)測(cè)細(xì)胞對(duì)外源性危害的反應(yīng)。在三維細(xì)胞傳感器的設(shè)計(jì)上,海藻酸鈉、鼠尾膠原和瓊脂糖等天然水凝膠常常被用以細(xì)胞在電極上的固定化。然而,這些水凝膠通常導(dǎo)電性和可塑性較差,且極易從電極表面脫落分離。此外,通過人工來修飾電極也會(huì)給測(cè)試結(jié)果帶來很大的個(gè)體誤差。因此,如何提高有效性、穩(wěn)定性及實(shí)現(xiàn)可批量性生產(chǎn)仍是生物傳感器研發(fā)的一項(xiàng)挑戰(zhàn)。
來自江南大學(xué)的孫秀蘭教授團(tuán)隊(duì)在“Bioelectrochemistry”上發(fā)表的“3D ‘honeycomb’ cell/carbon nanofiber/gelatin methacryloyl (GelMA) modified screen-printed electrode for electrochemical assessment of the combined toxicity of deoxynivalenol family mycotoxins”一文中,研究人員將3D打印技術(shù)引入生物傳感器的構(gòu)建過程,實(shí)現(xiàn)了精確、快速、可批量化地生產(chǎn)真菌毒素的毒性分析工具的目的。該方法是利用碳納米纖維/明膠甲基丙烯?;℅elMA)復(fù)合導(dǎo)電水凝膠構(gòu)建了三維細(xì)胞培養(yǎng)體系,通過電化學(xué)交流阻抗法測(cè)定其阻抗值判斷細(xì)胞受毒素刺激后的受損情況,從而真實(shí)、有效地評(píng)價(jià)真菌毒素細(xì)胞毒性。結(jié)合聯(lián)合指數(shù)法(CI)對(duì)DON、3-ADON及15-ADON的聯(lián)合毒性分析,并判定聯(lián)合作用類型。結(jié)果表明,該方法操作簡便、可重復(fù)性強(qiáng),顯示了高通量在線檢測(cè)分析的潛力,為真菌毒素的細(xì)胞毒性評(píng)估提供了一種新思路。
圖1 細(xì)胞電化學(xué)傳感器的構(gòu)建過程及其表征
首先,研究人員利用EFL團(tuán)隊(duì)提供的擠出式生物3D打印機(jī)(EFL-BP-6601)和GelMA生物墨水(EFL-GM-60)制備了一種電化學(xué)傳感器,并對(duì)其實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了相關(guān)的優(yōu)化。為提高絲網(wǎng)印刷電極(SPCE)的電化學(xué)靈敏度,金納米粒子(AuNP)被電鍍?cè)赟PCE的工作電極上,并通過摻入碳納米纖維進(jìn)一步提高GelMA水凝膠的導(dǎo)電性。打印填充方式的優(yōu)化中,“蜂巢”型的打印填充方式顯示出了優(yōu)于其他填充方式的導(dǎo)電性能。A549細(xì)胞/碳納米纖維/GelMA復(fù)合水凝膠通過3D打印程序被精確沉積于8通道絲網(wǎng)印刷電極的工作電極上,從而得到細(xì)胞電化學(xué)傳感器。水凝膠為細(xì)胞提供了類體內(nèi)的生長環(huán)境并能促進(jìn)細(xì)胞間相互作用。完整細(xì)胞膜的存在防止了氧化還原探針進(jìn)入電極表面,從而增加了電子傳遞阻力。當(dāng)霉菌毒素刺激細(xì)胞時(shí),發(fā)生細(xì)胞凋亡和死亡。因此,電子轉(zhuǎn)移加快了工作電極的導(dǎo)電率,根據(jù)細(xì)胞傳感器的阻抗值便可測(cè)得真菌毒素的細(xì)胞毒性。
其次,由于不同濃度的GelMA水凝膠會(huì)表現(xiàn)出不同的加工性能和生物相容性特征,研究人員評(píng)估了不同濃度的GelMA水凝膠的電導(dǎo)率及其對(duì)細(xì)胞活力的影響。結(jié)果表明,隨著GelMA濃度的增加,絲網(wǎng)印刷電極的電流值降低(圖2A),可見高濃度的GelMA不利于電子傳輸?;?死細(xì)胞染色分析(圖2C)可發(fā)現(xiàn),細(xì)胞在低濃度(5%-7.5%)的GelMA水凝膠中生長良好,并能觀察到細(xì)胞分化過程中的形態(tài)變化,細(xì)胞聚集成簇(如紅色框所示)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析(圖2B),A549細(xì)胞在5%-7.5%濃度的GelMA水凝膠中的存活率更高,超過93%。
圖2 不同GelMA濃度的電導(dǎo)率和生物相容性的比較
最后,將構(gòu)建的細(xì)胞傳感器暴露于不同濃度的DON、3-ADON和15-ADON中,以分析每種霉菌毒素的毒性。構(gòu)建的電化學(xué)毒性評(píng)價(jià)方法表明,真菌毒素降低了A549細(xì)胞的活性(圖3)。在三種霉菌毒素中,DON最有效地降低細(xì)胞活力,而3-ADON表現(xiàn)出最弱的細(xì)胞毒性。三種真菌毒素的半數(shù)致死率(IC50)如下:DON 0.9353 μg/ mL、3-ADON12.3194 μg/ mL和15-ADON1.3360 μg/ mL。為評(píng)估構(gòu)造的細(xì)胞電化學(xué)傳感器的準(zhǔn)確性,將本方法獲得的結(jié)果與傳統(tǒng)毒性評(píng)價(jià)方法CCK-8獲得的結(jié)果進(jìn)行了比較,可見兩種方法的結(jié)果具有良好的一致性。
使用所構(gòu)建的電化學(xué)方法進(jìn)一步對(duì)DON、3-ADON和15-ADON的聯(lián)合毒性進(jìn)行研究。圖4顯示了兩種或三種不同濃度比例的DON及其衍生物組合的聯(lián)合細(xì)胞毒性作用。采用CI聯(lián)合指數(shù)模型分析了各毒素組合的聯(lián)合毒性效應(yīng)。結(jié)果表明,DON +3-ADON、DON +15-ADON和DON +3-ADON + 15-DON的混合物對(duì)A549細(xì)胞產(chǎn)生幾乎完全拮抗的細(xì)胞毒性,而3-ADON和15-ADON的組合在低細(xì)胞抑制水平上發(fā)揮協(xié)同作用,而在中高細(xì)胞抑制水平則產(chǎn)生拮抗作用。
圖3 A549細(xì)胞暴露于DON、3-ADON和15-ADON后的細(xì)胞抑制率曲線(以CCK-8法和構(gòu)建的電化學(xué)方法作為比較)
圖4 DON、3-ADON和15-ADON聯(lián)合作用于A549細(xì)胞后的細(xì)胞抑制率曲線(以CCK-8法和構(gòu)建的電化學(xué)方法作為比較)
用于評(píng)估細(xì)胞毒性的傳感器適用于各種傳感應(yīng)用,包括毒素檢測(cè)和藥物評(píng)價(jià)。利用細(xì)胞作為生物傳感器元件可以在一定程度上模擬人體的生理反應(yīng),目前也已經(jīng)提出了許多用于毒性評(píng)價(jià)的生物傳感器的研究。然而大多數(shù)細(xì)胞傳感器的構(gòu)建都是基于人工操作,不可避免地會(huì)引入人為誤差。本研究開發(fā)了一種基于生物打印的可用于多樣品檢測(cè)的電化學(xué)傳感器,用于評(píng)價(jià)DON及其乙?;苌锏膯我缓吐?lián)合毒性。本研究表明,DON、3-ADON和15-ADON以劑量依賴性的方式引起細(xì)胞活力的顯著降低,本文中的常規(guī)毒理指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果還發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境信息系統(tǒng)與ROS水平、細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度、凋亡率和壞死率均有關(guān)系。該方法簡單、有效,為可批量化地生產(chǎn)毒物的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)工具提供新的方向。
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https://doi.org/10.1016/j.bioelechem.2021.107743
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