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       像差問題一直困擾著光學(xué)領(lǐng)域的工作者。像差會使光波前發(fā)生形變，不僅降低成像的信噪比和分辨率，使得很多時(shí)候我們只能“霧里看花”，更甚者，產(chǎn)生贗像，或無法獲得有意義的圖像。像差問題對雙光子成像的影響尤為嚴(yán)重，因?yàn)樵谀抢?，熒光信號對入射光?qiáng)度的依賴是平方關(guān)系，一旦入射光波前形變，不僅聚焦強(qiáng)度大幅下降，成像分辨率也急劇惡化。因此，如何解決像差問題，實(shí)現(xiàn)活體，例如小鼠大腦皮層，深層區(qū)域的高質(zhì)量成像成為光學(xué)成像發(fā)展中最具挑戰(zhàn)性的問題之一。

       美國Howard Hughes Medical Institute （霍華德·休斯醫(yī)學(xué)研究所）在Janelia Farm Research Campus的吉娜博士小組與來自中國科學(xué)院上海光學(xué)精密機(jī)械研究所強(qiáng)場激光物理國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的王琛博士最近成功將一種新的自適應(yīng)光學(xué)的方法和雙光子顯微鏡結(jié)合，研制出一種新的自適應(yīng)光學(xué)雙光子熒光顯微鏡。通過校正活體小鼠大腦的像差，在視覺皮層的不同深度處均獲得了提高數(shù)倍的成像分辨率和信號強(qiáng)度，大大改進(jìn)了成像質(zhì)量，使得原來在活體鼠腦中不可見或者模糊的細(xì)節(jié)變得清晰可見，她們成功將該方法應(yīng)用于老鼠視覺皮層第五層（約500µm）的形貌結(jié)構(gòu)成像和鈣離子功能成像。這一新的自適應(yīng)光學(xué)方法，首次使得在活體小鼠深層區(qū)域成像中獲得近衍射極限的成像分辨率成為現(xiàn)實(shí)。這一成果以Multiplexed aberration measurement for deep tissue imaging in vivo 為題發(fā)表在最新一期的Nature Methods （《自然·方法》）雜志上 （Published online 17 August 2014; doi:10.1038/nmeth.3068）。

       在該自適應(yīng)光學(xué)雙光子熒光顯微鏡中，她們將空間光位相調(diào)制器光學(xué)共軛到顯微物鏡的后焦平面，通過位相調(diào)制器將入射光分成若干子區(qū)域，每一塊子區(qū)域的波前都可以被獨(dú)立控制。同時(shí)，她們用數(shù)字微陣列光處理器，以不同的頻率同時(shí)調(diào)制其中一半子區(qū)域的入射光強(qiáng)度，以另一半子區(qū)域作為“參考波前”。來自所有子區(qū)域光束會在焦點(diǎn)處會聚干涉，通過監(jiān)測焦點(diǎn)激發(fā)的雙光子信號隨時(shí)間的變化情況，并進(jìn)行傅里葉變換分析，可以“分解”得到被調(diào)制的每一塊子區(qū)域的“光線”的貢獻(xiàn)信息，從而可以實(shí)現(xiàn)對一半子區(qū)域波前的并行測量。對另一半子區(qū)域重復(fù)這一測量過程，從而獲得整個(gè)入射波前的信息并進(jìn)行校正。該方法耗時(shí)很短，通常約1~3分鐘左右即可完成像差的測量和校正，無需復(fù)雜的計(jì)算，適用于任何標(biāo)記密度和標(biāo)記類型的樣品。更重要的是，得到的像差校正圖案可以用于提高較大視場范圍內(nèi)的成像質(zhì)量。該方法無疑為在體研究小鼠大腦皮層深層區(qū)域的生物、醫(yī)學(xué)問題提供了可行性方案。

       科學(xué)家研制成功新型自適應(yīng)光學(xué)雙光子熒光顯微鏡